Sykdomsproblemer hos torskelarver og yngel

Av Egil Karlsbakk, Sigurd O. Handeland, Magnus Devold, Frode Fridell og Are Nylund, Institutt for Fiskeri- og Marinbiologi, Universitetet i Bergen, Erling Otterlei og Geir Blom, Sagafjord Seafarm AS, Stord egil.karlsbakk@ifm.uib.no Produksjon av torskeyngel i intensive anlegg er en relativt ny næring i Norge. I 2002 ble det produsert ca. 3 mill. torskeyngel, hvorav ca. 1,7 mill. i slike anlegg1. Flere yngelanlegg på Vestlandet har i 2003 erfart massedødelighet i larvestadiet ca. to til tre uker etter startfôring. Vi studerte nærmere larver fra et slikt tilfelle. De affiserte larvene hadde typisk oppsvulmet buk og fløt halvdøde rundt på overflaten. Bukhulen var væskefylt, mens svømmeblæren var av normal størrelse (Figur 1). Vi refererer heretter til fenomenet som «flytersyke», siden dette begrepet alt er i bruk. Flytersyke er trolig et av de større problemene innen intensiv torskelarveproduksjon, og kan ha blitt sammenblandet med gassovermetning, et ikke uvanlig problem hos larver og yngel. Larver fra kar med og uten flytersyke ble studert i mikroskop, både på anlegget og ved IFM (UiB). Nylig avlivede larver ble anbrakt under oppstøttet dekkglass og studert gjennom høyre side. Ved disse undersøkelsene ble det observert omfattende tarminfeksjoner med bevegelige bakterier (motiler) hos larvene fra «syke» kar. Rundt 20% hadde slike tidlig i sykdomsutbruddet, men andelen steg raskt til over 80% i løpet av en uke. Ofte var infeksjonene massive, og det ble observert ødeleggelse av tarmslimhinnen assosiert med enorm bakterieaktivitet. Dette skjedde alltid i fortarmen (Figur 2?3). I mikroskopet kunne det hos enkelte larver også direkte observeres motile bakterier i den oppsvulmede bukhulen og i blodet, i capillær-årer. Dødeligheten ble i en affisert gruppe registrert til over 98% over en ti dagers periode. I en annen larvegruppe som ikke viste flytersyke og dødelighet ble det ikke observert slike massive tarminfeksjoner med motile bakterier. Alle disse foreløpige observasjonene antydet dermed at tidlige infeksjoner med motile bakterier kan ha forårsaket tarmskade og septikemier. De døende «oppblåste» torskelarvene inneholdt imidlertid færre bakterier, men hadde heller ikke føde i tarmen. Det ble konstaterte at svullen buk hos larver med flytersyke var forårsaket av forholdsvis store mengder væske (ascites) i bukhulen. Ascites er typisk ved flere typer infeksiøse sykdommer, også bakterielle, og kan også forklare selve «flyter-fenomenet». Vi mener larver med ascites flyter pga. bukhulevæskens lavere tetthet enn sjøvann. Vi testet denne forklaringen ved å overføre slike larver til brakkvann (10 ppm), der flesteparten sank til bunns. Hvor kommer bakteriene fra? Tidlig i forløpet ble det hos enkelte torskelarver uten synlige bevegelige bakterier i tarmen observert at mange av de spiste hjuldyrene inneholdt mengder slike bakterier. Når det ble sett nærmere på hjuldyr fra kulturene inneholdt disse motile bakterier, i lommer bak og lateralt i dyret eller i fordøyelsessystemet. Vanlig var også ubevegelige bakterietyper på overflaten. Dermed var det mulig at bakterieinfeksjonene hos torsken stammet fra hjuldyr (Brachionus)-kulturene; startfôret til larvene. Det kan også tenkes at torsken beitet på døde hjuldyr i tankene, hvor bakterier hadde blomstret opp på bløtvevene. Alternativt er det naturligvis mulig at bakteriene kom inn via inntaksvannet eller fra stamfisken. Følgelig ble det prøvd å isolere bakterier fra Brachionus-kulturene. Som forventet etter mikroskopieringen, kunne det på blodagar isoleres en rekke typer, og vi identifiserte tre grupper isolater med PCR (16S, ca. 1.360 bp): Pseudoalteromonas sp., Vibrio spp. og Listonella anguillarum (tidligere Vibrio anguillarum). Den siste er arten som kan forårsake klassisk vibriose, hjuldyrisolatet viste størst sekvenslikhet (>99%) med et serotype O2a isolat. Pseudoalteromonas er klebende ubevegelige staver, og kan derfor ikke være bakterien sett i tarmen. Vibrioisolatene fra hjuldyrene er ikke sikkert identifisert, men viser størst sekvenslikhet (95%) med patogene Vibrio harveyi-isolater fra fisk. Både Vibrio sp. aff. harveyi og L. anguillarum-isolatene er motile og hemolytiske, dvs. de skiller ut stoffer som ødelegger røde blodceller. Dette er egenskaper som forventes hos patogene bakterier. Siden vibriose (nå listonellose) hos torsk ofte forårsakes av L. anguillarum O2 og Vibrio sp. er beslektet med fiskepatogener, skulle en tro disse bakteriene kunne forårsake de massive tarminfeksjonene observert hos torskelarver ved begynnende flytersyke. Men en slik sammenheng har det ennå ikke lyktes å vise. Vi isolerte bakterier fra tarmen på torskelarver fra grupper med og uten flytersyke ved å desinfisere torskene utvendig med glutaraldehyd. Det ble isolert bakterier fra alle «syke» larver undersøkt, mens vi som regel ikke fikk vekst fra «frisk» gruppe. De fleste av de hittil identifiserte isolatene er motile bakterier er av vibriotypen, som med PCR (16S, ca. 1360 bp) og sekvenslikhet (99,7%) er identifisert som Vibrio logei. Pseudoalteromonas sp. er også påvist i et par tilfeller. V. logei er ikke en kjent fiskepatogen, og er heller ikke hemolytisk. Og der står saken i dag: V. logei er åpenbart en dominerende bakterie i tarmen på mange av larvene, men vi vet ikke sikkert om det er denne arten som danner «kratere» i tarmslimhinnen og dermed trolig systemiske infeksjoner. Videre arbeid må til for å belyse dette. Finnes det så noen støtte for denne hjuldyr-hypotesen i litteraturen? Hva sier litteraturen? Flere studier har dokumentert sykdom og dødelighet blant marine fiskelarver pga. Vibrio/Listonella-type bakterier2?6, og i noen tilfeller er det mistanke om at bakterier fra kulturer med levende fôr (Brachionus, Artemia) kan være kilden til infeksjonene4,7,8. En rekke vibriotype bakterier er kjent å forekomme i Artemia og Brachionus-kulturer. Som funnet av oss er Listonella anguillarum vanlig forekommende hos hjuldyr, men det er også isolert Vibrio diazotrophicus, V. rotiferianum, V. alginolyticus, V. mediterranei og V. tubiashii-lignende typer for å nevne noen9,10. Bakterier i kulturene kan være gunstige som fødeorganismer, være harmløse kommensaler f.eks. i tarmen eller virke negativt inn på kulturenes vekst11?15. Likedan kan disse bakteriene når de introduseres til fiskelarver ved startfôring være harmløse, gunstige (probiotiske, dvs. etablerer en gunstig og beskyttende tarmflora) eller patogener 2,8,16,17. Sterke indikasjoner på at bakterier fra rotatoriekulturer kan redusere vekst og overlevelse til fiskelarvegrupper kommer fra eksperiment hvor bakteriemengden i kulturer ble redusert, enten med antibiotika eller uv-stråling8,16. Det er også funnet en påfallende sammenheng mellom rotatorier som fôr og L. anguillarum dominans i tarmfloraen hos fiskelarver. Ofte resulterte dette i massedød p.g.a. alvorlige tarminfeksjoner2. Andre studier har også påvist at bakteriefloraen i tarmen i stor grad bestemmes av levendefôrets bakterier, altså hos hjuldyr og Artemia5,18,19. Tarmen er trolig også innfallsporten ved mange septikemier20. Det er vist at vibrio-type bakterier, inklusiv L. anguillarum, var dominerende i hjuldyr anriket og utfôret til larvene, i en rekke europeiske marine yngelanlegg9,21. Imidlertid er ingen av L. anguillarum stammene identifisert fra hjuldyr kjente fiskepatogene serotyper for yngel og voksen fisk9. Det virker derimot ikke usannsynlig at disse kan etableres i hjuldyrkulturer hvis disse blir kontaminert. Det er også et åpent spørsmål om ikke bakterier, som er forholdsvis ufarlige for yngel og større fisk kan være patogene for larver. Alt i alt gir litteraturen oss altså god grunn til å regne hjuldyr-kulturene som en mulig smittekilde. Andre sykdommer Ved IFM, UiB er det blitt undersøkt larver, yngel og ungfisk fra en rekke torskeanlegg på Vestlandet og nordover, og i flere tilfeller var sykdomsbildet annerledes enn ved flytersyke. Flere anlegg fikk akutte sykdomsutbrudd der fisken ble markert mørkpigmentert (enkeltfisk lyse) og svømte tumlende, ofte med knekk i kroppen som ved ryggradsdeformasjon. Klinikken er typisk for viral nervenekrose (VNN) eller rettere Viral Encephalopati og Retinopati (VER) forårsaket av nodavirus, særlig kjent i Norge fra kveiteyngel. Både i Canada og Skottland er det rapportert om utbrudd av VER hos torsk28,29. I larver og postlarver fra de nevnte utbruddene ble det histologisk funnet både vakuolisering og nodavirus lignende partikler i hjernen, men det er foreløpig ikke påvist nodavirus fra slike utbrudd med PCR-metoder som fanger opp alle kjente fiske-nodavirus. Så årsaken til denne «tumlersyken» hos torsk forblir ukjent; det blir en viktig oppgave for forskningsmiljøene å klarlegge denne gåten fremover. Ikke overaskende har vi også isolert Listonella anguillarum fra tarmen hos syke torskegrupper, og ofte også Vibrio wodanis og V. fisheri-lignende typer. Hos litt større torsk er det enkelte steder problemer med sykdommen sidelinjenekrose, en sykdom kjent fra naturen som en sjelden sykdom på større torsk. Ved denne sykdommen degenereres sidelinjenervene og cellelegemene i hjernen dør. Vi kikket nærmere på slik fisk og lurte på om nodavirus kunne være involvert. Vi påviste ikke nodavirus i fisk med sidelinjenekrose med PCR. Derimot fikk vi opp sekvenser som kan representere et hittil ukjent fiskevirus, både fra donorfisk og eksperimentelt smittet torsk. Videre arbeid trengs for å belyse om dette representerer agens bak torskens sidelinjenekrose. Vi kan bare konkludere med at her er det mye å ta fatt i! Arbeidet er støttet av SND. De endelige resultatene blir presentert på konferansen «Aqkva?» arrangert på Stord 22. januar 2004. Referanseliste fås ved henvendelse til E. Karlsbakk.